文獻賞析

華盈視角:可變剪切-信號通路與膠質瘤發病機制研究

2019/07/05

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(剪接因子SRSF1通過MYO1B致癌剪接轉換促進膠質瘤形成)

本文涉及磷酸化抗體芯片技術及其關鍵生物信息分析由華盈生物提供


       基因的異常剪接與腫瘤的發生密切相關, 由剪接因子改變引起的異常選擇性剪接(AS)有助于腫瘤進展。絲氨酸/精氨酸富集剪接因子1(SRSF1)是選擇性剪接因子家族的代表性成員,主要參與前體mRNA的剪接與加工、mRNA的運輸、細胞周期、凋亡的調控等生理功能。但其在膠質瘤中的作用和機制尚不明確。本研究中,天津醫科大學于士柱教授研究團隊使用RNA-seq、CO-IP等技術,首先找到了SRSF1通過AS調控的基因MYO1B(肌球蛋白B)。并進一步證實,MYO1B經過AS后會形成MYO1B-fl蛋白,表達于細胞膜,并促進膠質瘤細胞的增殖和侵襲。通過華盈生物磷酸抗體芯片CSP100篩選,研究人員快速找到了介導MYO1B-f蛋白促膠質瘤細胞的增殖和侵襲的關鍵通路: PDK1/AKT和PAK/LIMK,為揭示膠質瘤形成與發展提供了重要證據。文章近期發表在JCI雜志上(PMID:30481162)。

 
華盈視角解讀:
1. SRSF1在膠質瘤中的高表達預示著預后病情惡化

       本研究首先通過基因測序分析, 初步探討SRSF1基因與膠質瘤組織病理特征的相關性。從mRNA的定量水平顯示,與正常組織相比,膠質瘤組織SRSF1mRNA表達水平顯著升高(圖1A),同時WB結果顯示,在組織和細胞層面上均證明與正常組比較,SRSF1 蛋白水平上也顯著增高(圖1B)。同時發現,SRSF1的表達與增值指標Ki67呈現正相關(圖1C),一致顯示,SRSF1的上調與膠質瘤發生發展密切相關,預示SRSF1是膠質瘤患者的潛在預后生物標志物。


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圖1 SRSF1在膠質瘤中的高表達預示著預后病情惡化

 

2. SRSF1增加神經膠質瘤細胞的致瘤潛力

        進一步,為了深入探究SRSF1是否對膠質瘤具有致癌作用,研究人員對4種膠質瘤細胞(U87MG、U251、LN229和SNB19)的中SRSF1進行有效敲除(圖2A)。與對照siRNA相比,干擾掉剪接子SRSF1后顯著抑制了這些細胞的生長。(圖2B)。


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圖2 SRSF1增加神經膠質瘤細胞的致瘤潛力


       為了進一步確認SRSF1是否在SRSF1介導的過程中起重要作用,研究人員設置一系列實驗組和相應的對照組別:WT+vec(共表達熒光素酶的慢病毒)、KD+vec(SRSF1 shRNA)、KD+ SRSF1-mu(SRSF1-mu感染KD亞細胞系)、vec、WT+vec、KD + vec(圖3A)。體外和體內實驗。同樣證實了之前的結論,SRSF1基因敲除嚴重抑制了細胞增殖,存活率、侵襲能力,而SRSF1恢復顯著修復上述缺陷(圖3B、3C)。這些結果表明SRSF1對膠質瘤細胞的增殖、存活和侵襲是一種有效的啟動子。

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圖3 SRSF1增加神經膠質瘤細胞的致瘤潛力


3. SRSF1影響AS基因表達的全面調控

       為了探究SRSF1在膠質瘤發育中調控的AS事件,通過對U87MG和U251的WT和KD亞細胞進行RNA高通量測序。共鑒定出1348和1332個SRSF1調控的事件。這些AS事件分為5類,主要的事件屬于跳躍的外顯子(SE)類別(圖4A/4B)。隨后的分析表明SRSF1具有雙重作用剪接激活劑和抑制劑(圖4C)。重要的是,這些重疊的受SRSF1影響的多數剪接靶標參與細胞骨架組織和黏附區域中的腫瘤相關功能(圖4D/4E)。

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圖4 SRSF1影響AS基因表達的全面調控


4. 探究SRSF1誘導的AS機制 

       研究人員隨后驗證了U87MG和U251細胞共同調控的前50個受SRSF1影響的AS事件。RT-PCR驗證了12個AS事件的代表性結果。這些結果證實SRSF1激活(圖5A)或抑制(圖5B)靶外顯子/內含子的剪接。進一步,通過免疫沉淀及RT-PCR結果驗證SRSF1與肌球蛋白IB(MYO1B)外顯子23和24有結合。SRSF1敲低顯著導致2個相鄰外顯子的跳躍并促進截短的MYO1B(MYO1B-t)同種型的表達,同時發現,全長MYO1B蛋白(MYO1B-fl)敲低能夠有效抑制GBM細胞的生長而非MYO1B-t(圖5C)。最終顯示, MYO1B-fl水平表達量增高與SRSF1表達相關聯。

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圖5 探究SRSF1誘導的AS機制


5. SRSF1誘導的MYO1B剪接通過PDK1/AKT和PAK/LIMK通路決定細胞命運 

       為了更好地理解由SRSF1敲低帶來的抗癌作用機理,研究人員采用華盈生物提供的磷酸化抗體芯片技術CSP100,快速篩選SRSF1敲低的膠質瘤細胞中12條經典腫瘤信號通路的調變情況(圖6A)。以調變15%為cut off值(圖6A),研究人員找到了一系列與腫瘤增殖及侵襲相關的通路蛋白發生了顯著調變。其中,就包含AKT、Actin、MAPK等腫瘤增殖及侵襲關鍵通路中的主要蛋白磷酸化明顯下調(圖6B)。進一步,將MYO1B-fl過表達后(Rescue實驗),利用Western blot實驗對這些蛋白進行驗證,發現SRSF1敲低帶來的磷酸化下調得到顯著恢復,說明這些通路及分子是介導SRMF1/MYO1B-fl致癌作用核心通路(圖6C)。

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圖6 SRSF1誘導的MYO1B剪接通過PDK1/AKT和PAK/LIMK通路決定細胞命運
 

小結
       
本文是一篇經典的新基因功能研究范文。研究人員發現可變剪切蛋白SRSF1在細胞核內調控MYO1B基因的可變剪切,其終產物全長MYO1B蛋白(MYO1B-fl)表達于細胞膜上,可進一步介導膠質瘤的增殖和遷移。

       然而,作為可變剪切蛋白,MYO1B-fl非常新,沒有文獻對其在膠質瘤中的促癌功能和機理進行過相關報道。MYO1B-fl如何調控膠質瘤的增殖和遷移?研究人員需要從零開始。尋找能夠傳遞MYO1B-fl信號的經典通路是關鍵一步,面對多條信號通路篩選難題,研究人員果斷運用華盈生物提供的磷酸化抗體芯片技術來篩選SRSF1敲低后多條經典腫瘤相關信號通路的變化,成功鎖定PDK1/AKT和PAK/LIMK通路,并最終揭開SRSF1復雜的促癌機制(圖7)。

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圖7 機理總結圖


啟示

        本研究實驗設計十分經典,為其他研究人員的類似研究提供了很好的技術范本,尤其當生物現象背后涉及到復雜信號通路變化時,華盈生物提供的廣譜信號通路磷酸化抗體芯片可以為科研人員節省大量時間,并能夠在復雜信號網絡中鎖定到關鍵核心蛋白及磷酸化位點。 華盈生物的PEX100芯片及CSP100 plus芯片,一次芯片實驗即可實現多達31條或16條信號通路的同步篩選,由此成為此類研究中信號通路研究階段的首先技術。

 

英文文獻鏈接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6355305/

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