文獻賞析

華盈視角:新的乙肝病毒基因亞型可預測中期肝癌的預后

2019/08/02

        乙肝在我國有非常龐大的患者群體,而乙肝患者如果長期得不到緩解,出現肝硬化的表現,最終可能向肝癌發展。而針對乙肝發病的元兇——乙型肝炎病毒(HBV)的研究還遠遠不夠。乙型肝炎病毒X.基因(HBx)是HBV基因組的四個開放閱讀框之一,可編碼17kDa的蛋白質,科學家已經發現HBx的變異與肝細胞癌(HCC)進展密切相關。然而,目前基于全長HBx序列的基因型和基因型分類研究,還不能做到使用HBV基因對HCC的進展進行預判。華盈生物合作伙伴-東方肝膽外科醫院周偉平教授團隊,采用了測序技術成功發現了HBx新的突變基因型HBx-E2,證實了該突變可作為HCC診斷的新biomarker。通過人類蛋白質組芯片技術進一步發現了HBx-WT可結合宿主蛋白JAK1, 而HBx-E2不能結合JAK1蛋白,進而HBx-E2不能夠通過激活JAK1-STAT通路進一步促進HCC的發生,使得HBx-E2基因型HCC病人獲得更好的預后。該研究不僅發現了新的HCC預后診斷標志物基因,并對該基因調控預后的詳細機理進行了闡述,相關成果近期發表在國際頂級學術期刊《Journal of Hepatology》(PMID: 30654066)上。

 

華盈視角解讀???

1. 發現集:組織樣品中發現HBx變異與HCC進展相關和預后相關
        乙型肝炎病毒X基因(HBx)的遺傳變異經常發生,臨床上觀察到該變異與肝細胞癌(HCC)進展密切相關。然而,目前基于全長HBx序列的基因型和基因型分類仍然不能預測HBV對HCC進展的影響。

        為了改善這一現狀,作者先使用primarycohort(發現集,組織樣本,n=284)對HBx DNA進行測序和聚類分析,將全長HBx基因的基因型進行分類。在發現集隊列中,通過對腫瘤和非腫瘤組織樣品中的HBx DNA中的變體基因座的聚類分析鑒定了三種HBx基因型:HBx-EHBH1,HBx-EHBH2和HBx-EHBH3(圖1)。紅色表示突變,藍色表示無突變。

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圖1 HBx DNA中變體基因座聚類分析 

 

        進一步通過生存率曲線分析,發現攜帶HBx-EHBH2(HBx-E2)基因型HCC患者的無復發生存期(RFS)和總生存期(OS)更好(圖2)。


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圖2 發現集HBx-E2基因型的生存率更好


2. 驗證集:血清+組織樣品驗證HBx-E2基因型HCC預后更佳

        作者后續利用validation cohort(驗證集,組織,n=171;血清,n=168)對訓練集結果進行檢測驗證。通過對組織樣本分析發現:HBx-E2基因型在BCLC B(巴塞羅那分期,B期)的預后診斷效果更顯著,同時,HBx-E2基因型攜帶者預示著更高的生存率(圖3)。

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圖3 HBx-E2較適用于BCLC B期


        由于血清樣品相較于組織更容易收集獲取,更利于檢測標志物,研究人員進一步檢測血清中的HBx-E2基因型,發現HBx-E2攜帶者的無復發生存期(RFS)和總生存期(OS)也更好。而且同樣在BCLC B期患者中p<0.05,這對TACE(肝動脈化療栓塞術:BCLC B期患者建議治療方法)治療后患者的預后評估有非常重要的意義(圖4)。

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圖4 血清基因型生存率差異


3. 細胞動物層面驗證不同基因型功能

        為了證明HBx的各個基因型功能,作者用HBx-WT序列的相應位點替換為HBx-E2基因型變體的非同義基因座,獲得HBx-E2-非同義(HBx-E2-N)序列。通過用HBx-E2的變體位點的同義基因座取代HBx-WT序列的相應堿基,獲得HBx-E2-同義(HBx-E2-S)序列,進行了后續的一系列實驗。

        細胞和動物實驗的結果均顯示HBx-E2和與其同義的HBx-E2-N在體外和體內喪失了促進HCC增殖,細胞周期和凋亡的能力,但具體它是通過什么途徑介導的尚不明確(圖5)。


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圖5 不通基因型在動物細胞層面的影響


4. 通過人類蛋白質組芯片找到HBx-WT與HBx-E2的差異互作蛋白

        為找到闡明HBx-E2和與其同義的HBx-E2-N基因型喪失促進HCC增殖,細胞周期和凋亡能力的原因,作者對HBx-WT和HBx-E2這兩種蛋白的直接結合蛋白進行探索,尋找它們各自特有的互作蛋白。首先體外重組表達了這兩種基因型蛋白,并與華盈生物合作,采用Huprot 20K人類蛋白質組芯片(覆蓋2萬種人類全長蛋白)技術,快速找到了42種蛋白質可與HBx-E2和HBx-WT相互作用。其中,有16種蛋白質只與HBx-WT基因型相互作用。16種結合蛋白中的三種(JAK1,RBBP4,CAP2)與HCC的發生與發展相關。而JAK1作為將細胞因子信號轉導至STAT的分子,在細胞增殖中起關鍵作用。因此,作者后續選擇了JAK1進行驗證,通過進行CO-IP加WB、免疫熒光共定位等實驗證明了HBx-WT蛋白與JAK1之間確實存在物理相互作用。(圖6)


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圖6 互作蛋白篩選及驗證


5. JAK-STAT信號通路調控機理

        HBx-WT已經通過人蛋白質組芯片及相關實驗證明可與JAK1相互作用,那么它是否會影響其活性等進而影響整個JAK-STAT通路呢?

        WB和IHC顯示JAK1、STAT3、STAT5的磷酸化水平活性在HBx-E2和HBx-E2-N中明顯下降(圖7),可見HBx-E2對JAK-STAT通路激活能力明顯下降,而JAK / STAT信號通路與細胞的增殖,細胞周期,凋亡和分化密切相關。


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圖7 WB及IHC等驗證JAK-STAT通路


        所以作者最終提出機制假說:HBx-WT變異為HBx-E2后,其表達的蛋白失去與JAK1相互作用,進而失去了激活JAK1 / STAT通路的能力,最終導致細胞增殖受阻(機制原理見圖8)。


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圖8 機制原理圖


小結

        綜上所述,在本研究中,作者通過測序發現了新的HBx突變基因型,并構建對應的同義和非同義序列,證明其功能,最終利用人類蛋白組芯片技術快速找到了相較于突變體HBx-E2,HBx-WT特有的多個直接結合蛋白,快速鎖定到與HCC密切相關的JAK-STAT通路上游分子JAK1蛋白。這對于后續解釋HBx-WT基因變異導致腫瘤進展受阻機理至關重要,大大縮短了實驗周期,為機制解釋指明了方向。

        縱觀全文,作者的思路非常清晰,從發現集中發現新的基因型,進一步分析發現其對中期HCC具有預后評估意義,驗證集加入血清樣品重視臨床可行性,更難得的是進一步進行功能及機制研究,闡明了HBx-E2基因型攜帶者具有更好預后的原因。該研究思路清晰,實驗設計嚴謹,技術路線經典(圖9),值得華盈視角推薦。


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圖9 全文技術路線圖


        在機制探索方面,作者利用華盈生物推出的人類蛋白組芯片技術,篩選互作蛋白,幾周內快速鎖定了JAK1蛋白,效率之高遠超傳統技術。人類蛋白組芯片在篩選互作蛋白研究中具有如下特征性優勢
1. 芯片實驗為體外實驗,芯片上每個蛋白點相互獨立,保證篩選到的互作蛋白均為目標蛋白的直接結合蛋白,數據分析簡單。

2. 體內環境復雜,很多蛋白結合現象稍縱即逝,并且蛋白表達存在空間和時間上的差異,利用體外環境條件下的篩選,可以很快發現很多潛在結合靶標,結合每個蛋白的生物學功能再進行后續實驗驗證的實驗策略更加高效,數據也更加全面。

3. 在不同組織、細胞、細胞器中,蛋白的表達豐度差異很大,傳統的CO-IP等實驗很難發現低豐度蛋白的互作現象,人類蛋白組芯片上的蛋白是酵母純化表達的蛋白,可以保證每種蛋白的豐度,芯片實驗容易發現潛在蛋白互作現象。

4. 利用人類蛋白組芯片實驗篩選互作蛋白,從蛋白質層面分析互作數據,避免了CO-IP后質譜鑒定時,從多肽水平跨層分析互作蛋白的不確定性和復雜性。

5. 相比酵母雙雜交實驗,蛋白芯片實驗周期短、假陽性率低,方便復雜實驗設計,可以設計多種實驗對照,更能確保互作蛋白數據的準確性。

 

英文文獻鏈接:https://www.journal-of-hepatology.eu/article/S0168-8278(19)30018-2/pdf

 

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