文獻賞析

華盈視角:糖尿病腎病研究新進展

2019/10/29

 

        糖尿病腎病(DKD),是慢性腎病的主要類型,治療手段有限。在我國,傳統中藥被普遍應用于治療糖尿病與其并發癥。臨床研究表明,牛蒡子與其它中藥聯合或單獨使用對糖尿病腎病患者的蛋白尿癥狀具有明顯的改善作用,但目前暫不確定其具體作用機制。牛蒡子的主要成分為成分牛蒡子苷元(Arctigenin, ATG),體外研究發現,ATG具有多重細胞作用,包括抗癌細胞增殖,抗炎抗氧化作用等等。然而尚不清楚的是,牛蒡子對糖尿病患者的腎保護作用是否來源于ATG這種成分。

        上海中醫藥大學鐘逸斐研究團隊發現ATG單獨使用可顯著地改善糖尿病腎病所帶來的蛋白尿以及足細胞損傷現象,并進一步闡明了ATG對腎保護的分子作用機制。該研究揭示了ATG通過對PP2A的激活,降低p65 NF-kB介導的炎癥反應和去磷酸化DBN1,進而緩解腎臟炎癥與保護足細胞損傷,實現對腎臟的保護作用,并將PP2A列為研究DKD進展的潛在靶標。該文章近期發表于著名國際學術期刊Nature Communication(PMID: 31586053)。

 

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  1. ATG對糖尿病小鼠模型的腎保護作用

         為了確定ATG對DKD是否具有腎保護作用效果,本研究使用鏈脲佐菌素STZ誘導小鼠患糖尿病(圖1A),實驗處理分為四組:未患病無效藥物處理組(-STZ +Vehicle),未患病ATG治療組(-STZ +ATG),患病無效藥物處理組(+STZ +Vehicle),患病ATG治療組(+STZ +ATG)。

        研究發現ATG治療對糖尿病小鼠具有腎保護作用。ATG可有效減輕蛋白尿癥狀(圖1B),減少糖尿病小鼠的腎小球肥大和腎小球基質膜擴張(圖1C&D)。透射電鏡圖(TEM)顯示,在糖尿病小鼠腎臟中有明顯的足細胞消失和損傷現象(圖1E),而ATG處理可逆轉這種情況(圖1E&F)。并且通過對足細胞特異性標志蛋白—WT1蛋白的表達來定量足細胞數目,可得出一致的結論:ATG減輕了糖尿病小鼠足細胞的損失(圖1G&H)。

 

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圖1. ATG對患糖尿病小鼠的腎臟保護作用

 


 2. ATG可調節細胞黏附、肌動蛋白細胞骨架與炎癥反應

       為了闡明糖尿病中ATG賦予的腎保護的潛在機制,研究人員對四組實驗組小鼠腎小球進行了RNA測序。主成分分析(PCA)顯示四個實驗組的RNA表達情況總體上具有明顯區分(圖2A)。從Venn圖中可以看出,在糖尿病小鼠中,ATG可減小患病所帶來的差異性表達基因(DEG)的變化(圖2B)。并且Heatmap也顯示出經ATG保護后Top 50的DEGs表達差異情況可被逆轉(圖2C)。使用GO Biological Process, Wiki Pathways和KEGG Pathways進行基因富集分析,發現細胞粘附、肌動蛋白細胞骨架和炎癥反應調節是ATG逆轉差異表達基因的主要途徑。Real-time PCR定量小鼠腎小球mRNA的結果證實了在ATG處理后,細胞粘附和肌動蛋白調解途徑中(Gfra1, Itgb7, Washc1, Was, Zyx)幾種關鍵基因的變化(圖2D),ATG治療后可改善細胞粘附力并減弱在高糖培養基條件下足細胞的遷移。

 

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圖2.糖尿病對小鼠腎小球的RNA表達調控      

        這些結果均表明ATG的腎保護作用是通過改善足細胞黏附并降低其運動性,以及調節肌動蛋白細胞骨架,從而使患糖尿病的小鼠腎臟中足細胞活力和功能增強。


3.在腎細胞中,PP2A為ATG的靶蛋白

         為了確定ATG作用于足細胞的分子機制,作者利用藥物親和力反應靶標穩定性(DARTS, Drug affinity responsive target stability)方法來檢測在腎細胞中ATG的潛在結合蛋白。DARTS是一種相對快速直接的方法,可識別小分子的潛在蛋白質靶標,其基于的原理為:小分子化合物與目標蛋白結合后會改變其構象,從而使蛋白質更加穩定不易被水解。該方法的最大優點是能夠使用天然小分子,而不用固定或特殊修飾(e.g. 摻入生物素,熒光或放射性同位素標記)。作者利用DARTS識別ATG潛在的結合靶標并聯合DARTS-Western Blot印記法測試、篩選和驗證。DARTS/Western Blot的結果證實了PP2A為ATG的靶蛋白,并且PP2A與ATG之間的相互作用呈劑量依賴型(圖3)。

        然而DARTS的局限性也是顯而易見的,基于用于DARTS的大多數小分子靶標都是未知的,因此這種結合力親和力也將是未知的。這種相關性可能并非對所有化合物和生物系統都有效,并且只能根據化合物的版最大效應濃度EC50估算與最相關靶標的結合親和力。因此,非常遺憾的是DARTS這種方法并不能更廣泛更全面的找到藥物分子靶點。如果研究人員可以利用HuprotTM 20K人類蛋白質組芯片進行ATG靶蛋白的篩選可能會找到更多的藥物分子靶點,為全面揭示ATG作用機理和藥物潛力打下更為廣泛的基礎。

        PP2A, 即蛋白磷酸酶2,是絲氨酸/蘇氨酸磷酸化酶,異源三聚體,由結構亞基A、調節亞基B、和催化亞基C組成。研究人員進行計算建模分析預測和表面等離子共振(SPR)來確定ATG在PP2A上的結合位點,結果均顯示它們的結合位點位于亞基A處,靠近于亞基A和亞基C之間的空隙(圖3B&C)。接下來,研究人員發現在體內或體外/正常或高糖環境下,ATG處理均可增加PP2A的活性,并且PP2A的活性隨著ATG的濃度增加而升高(圖3D-F)。

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圖3. ATG與PP2A結合并可增加PP2A的活性


4. ATG通過增加足細胞中PP2A的活性來抑制NF-κB信號通路

        糖尿病腎病的最顯著的特征為炎癥加劇。先前研究表明PP2A是多種炎癥信號通路的負調節劑,包括p65 NF-κB的去磷酸化和阻遏作用。那么,ATG是否可以通過增強PP2A的活性來減少NF-κB介導的腎炎癥反應呢?為印證這一觀點,研究人員應用Western Blot來檢測小鼠腎小球中p65 NF-κB的磷酸化程度。結果發現,ATG治療可顯著下調p-p65,降低p65 NF-κB磷酸化(圖4A)。在體外培養的足細胞中,進一步證實ATG治療可抑制TNF-α介導的p65磷酸化(圖4B),并且ATG的p65去磷酸化作用為劑量依賴型,即ATG濃度越高,p65磷酸化程度越低。然而,ATG的炎癥抑制效果會因為PP2A失活而無效。當作者利用岡田酸(OA)來抑制PP2A活性時,ATG的p-p65去磷酸化作用消失(圖4C)。以上數據均說明了ATG的腎保護作用是通過PP2A的抗炎效應來實現的。

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圖4. ATG通過激活PP2A緩解TNF-α誘導的炎癥


5.PP2A通過DBN1來調節肌動蛋白細胞骨架

        接下來,為了討論ATG是怎樣改善糖尿病小鼠的足細胞功能的,研究人員利用免疫共沉淀(co-IP)結合質譜技術,檢測了與PP2A反應的蛋白,最終確定了Drebrin-1(DBN1)是ATG/PP2A保護足細胞的靶蛋白,并發現ATG/PP2A在DBN1的具體位點為T335(圖5A)。同時表明由ATG介導的PP2A激活是通過DBN1 T335的去磷酸化來改善足細胞粘附和降低細胞遷移(圖5C&D)。最終研究人員揭示了足細胞足突處DBN1的表達,與介導足突形成的F-actin相互作用,穩定了肌動蛋白纖維并調節細胞遷移的重要機制。

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圖5. PP2A通過DBN1來調節足細胞肌動蛋白細胞骨架


  6. ATG的腎保護作用在PP2A足細胞特異性敲除小鼠中失效

        上述結果已證實PP2A為ATG的靶蛋白,并且PP2A的腎保護作用也是通過激活PP2A來實現的。如果假設PP2A不復存在,那么DKD癥狀將會怎樣發展?ATG是否還具有腎保護作用呢?為了解答這些問題,研究人員采用足細胞特異性PP2A敲除小鼠Pod-PP2A-/-進行驗證,結果表明,在PP2A缺陷型糖尿病小鼠中,蛋白尿癥狀加劇(圖6A),腎小球肥大和腎小球基質膜擴張(圖6B),足細胞數目減少損傷加重(圖6C)。說明在PP2A缺失的條件下,DKD炎癥加重,病情惡化。

 

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圖6. PP2A缺陷加劇DKD,增加足細胞損傷,使ATG腎保護作用失效

        并且,在Pod-PP2A-/-小鼠中,ATG對糖尿病小鼠的腎臟保護作用喪失(圖6D-G)。這些結果共同表明了ATG主要通過調節PP2A活性來發揮作用,并揭示了PP2A在糖尿病引起的足細胞損傷中的關鍵性調節作用。

 


 

 

 

  技術路線總結:

流程圖 [已恢1.png

原文鏈接地址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31586053/


 總結與討論:

        本研究發現了牛蒡子苷元(ATG)作為牛蒡子的有效活性中藥成分,對糖尿病具有腎保護作用,可緩解糖尿病引發的蛋白尿和足細胞損傷現象。作者利用DARTS(Drug affinity responsive target stability)方法來預測PP2A為ATG的靶蛋白,為后續研究打下了堅實基礎。

        在小分子機制研究中,小分子靶點篩選和確定是打開潘多拉魔盒的關鍵一環。中藥小分子具有多靶點特性,PP2A是ATG的一個重要的靶蛋白,而一定不是唯一的靶蛋白。如果作者利用HuprotTM 20K人類蛋白質組芯片進行ATG靶蛋白的篩選可能能夠找到更多的小分子靶點,為全面揭示ATG作用機理和藥物潛力打下更為廣泛的基礎。
        HuProtTM 20K人類蛋白質組芯片,是目前國際上通量最高的蛋白質芯片,芯片結合了21,000種人類全長蛋白質,覆蓋81%的人類基因組ORF區。蛋白質全部采用酵母表達系統表達,逐個進行純化與鑒定。每個蛋白質在芯片上均設置2個技術重復點,同時,芯片上還設置多種質控點確保實驗體系穩定可靠。

 

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相比傳統pull down+MS實驗體系,HuProtTM 20K芯片具有以下優勢:

1)體外實驗,蛋白濃度有保證,檢測效率高

2)無需 CO-IP 和細胞培養,省時、簡便

3)可確定直接結合蛋白,數據分析簡單

4)通量高,實驗設計更加靈活

5)驗證效率高,實驗結果準確、全面

6)實驗步驟簡單,有效減少系統誤差

 

基于上述優勢,HuProtTM 20K芯片在諸多領域都顯示出巨大潛力

 

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