文獻賞析

華盈生物:肺結核診斷標志物研究新突破

2019/11/14

        肺結核被列為引發全球人口死亡的十大原因之一,每年造成全球約170萬人死亡。最近在非洲和亞洲的流行率調查顯示,多達三分之一的活動性肺結核(ATB)患者未被確診,因而未得到治療,迫切需要改進診斷方法,以便發現、治療從而減輕活動性肺結核的巨大全球健康負擔。近日來自哈佛大學和麻省理工學院Broad研究院等研究機構的研究人員,應用Luminex平臺和Simoa超高靈敏蛋白檢測技術,開發出一種基于血液的檢測方法可用于診斷活動性結核病,相關研究發表在最新一期國際頂級期刊《Science Translational Medicine》上,PMID: 31645455。


華盈視角為您傾情解讀

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                研究機構:哈佛大學和麻省理工學院Broad研究院、哈佛醫學院布列根和婦女醫院等

   ?   研究背景

        目前結核病的檢測技術是對病人的痰液進行顯微鏡檢查,并用Ziehl-Neelsen抗酸染色的技術,這種方法靈敏度不足且依賴于操作人員技術,并且固體或液體培養方法緩慢,對實驗室基礎設施有要求,限制了在結核病高發但資源有限的環境中使用。此外,兩個最脆弱和受影響最大的群體,即感染艾滋病毒的兒童和成人,由于難以獲得痰液且樣本中的細菌含量低,不太可能用痰液來診斷。一些商業血液檢測試劑試圖填補這一空白,但有證據表明這些檢測準確度不高,世界衛生組織強烈建議不要使用這些商業化檢測試劑盒用于診斷肺結核。因此目前急需一種快速、簡單、低成本、高靈敏度的診斷方法。

   ?   研究方法 :

       Discovery Cohort:使用Luminex多因子檢測平臺篩選387例結核病癥狀患者血漿中的47種宿主炎癥蛋白,結合機器學習算法篩選到4種與活動性結核病相關的蛋白。

       Validation Cohort:進一步利用Simoa超高靈敏蛋白檢測技術檢測樣品(N=406)并優化模型。

       Verification Cohort:利用Simoa技術對317例雙盲血液樣品進行診斷模型驗證和評估蛋白標注物性能,從而區分活動性結核病和其他結核病相似類的疾病。

   ?   研究結果 :


1、 基于免疫蛋白測定和機器學習算法發現潛在標志物

       采用Luminex多因子檢測技術對387結核病患者血漿樣本進行47種宿主蛋白的分析(其中199 例活動性結核病(ATB)、188 例其他持續性咳嗽的活動性結核病類似癥狀的疾病(OTD))。過濾掉缺失值大于50%的蛋白,并根據其在血漿中的濃度對候選標志物進行分層后,使用TreeNet機器學習算法進行10倍交叉驗證,以12種蛋白為基礎建立模型(表1a)。TreeNet算法篩選到四種蛋白質標志物:IL-6、IL-8、IL-18和VEGF,建立一種ATB診斷模型,其準確度為0.87,敏感性86%,特異性65%(表1b)。

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表1 Discovery 和Validation Cohort建立ATB診斷模型


2、 基于超高靈敏檢測Simoa技術改進ATB診斷模型

      盡管基于Luminex檢測結果構建的算法在發現隊列中的表現出令人鼓舞的性能,但Luminex分析平臺的分析靈敏度有限,意味著許多血漿樣本部分蛋白質(包括標志性蛋白IL-6、IL-8、IL-18和VEGF)存在缺失值(低于Luminex分析的檢測限)。因此,最佳分析物的全動態值范圍無法被用于生成分類算法。為了解決這一局限性,研究人員選用了Simoa超高靈敏技術平在Validation Cohort階段檢測這四種蛋白標志物(樣品數量N=406,其中199 例ATB、188 例OTD、19例治愈對照組),以獲得連續性檢測數據。

        結果發現ATB的蛋白質濃度顯著高于OTD和治愈對照組,ATB中IL-6的平均濃度約為OTD的4倍。19個治愈對照組的IL-6平均濃度遠低于ATB組。ATB與OTD患者相差2.4倍。IL-8和VEGF的表達模式相似(圖1)。研究人員表示,如預期的那樣,與Luminex技術相比,Simoa對每種分析物的分析靈敏度高出幾個數量級,在很大程度上消除了最初Discovery Cohort的缺失值問題,并有可能實現通過指尖獲得的血量進行檢測。

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圖1 Simoa檢測的標志物蛋白濃度連續分布情況——Discovery Cohort

       由于Simoa超高靈敏度改變了血漿蛋白的檢測閾值,可以獲得全動態值范圍的連續性檢測數據,利用TreeNet機器學習算法與Simoa衍生數據集重新進行10倍交叉驗證,結果顯著改善了ATB診斷模型的性能:交叉驗證準確度為0.85(ROC-AUC),敏感性為87%,特異性為66%(表1c、圖2)。

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圖2 基于Simoa數據集的ATB診斷模型ROC判別


 

  3、 ATB分類算法的驗證

       為了驗證該診斷模型并評估其性能,利用Simoa技術,使用來自三個國家的317例完全獨立的雙盲實驗收集的臨床血液樣本評估了四種蛋白標志物。與Discovery Cohort一樣,Validation Cohort階段的ATB組、OTD組和治愈對照組的IL-6、IL-18和VEGF濃度存在顯著差異(圖3)。TreeNet算法的準確度(ROC-AUC)為0.80,敏感性為80%,特異性65%(表2C),所有數據均有超高靈敏技術Simoa獲得。

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圖3 Simoa檢測的標志物蛋白濃度連續分布情況——Verification Cohort


   ?   小結 :

       研究人員將Luminex多因子檢測技術與Simoa超高靈敏蛋白檢測技術聯合起來,利用了Luminex多因子檢測技術的高通量以及Simoa技術的超高靈敏度,找到了區分活動性結核病和其他結核病相似癥狀疾病的血液中生物標志物,研究思路清晰、新穎,值得推薦!


 

 ?   技術路線:
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        面對外周血蛋白標志物開發的研究需求,華盈生物發揮核心團隊標志物研究的背景優勢,站在研究人員的角度思考問題,打造了一套完整的蛋白標志物研究服務體系:我們從實驗初期數千種蛋白質的高通量篩選(固相芯片),到實驗中期數百例樣本多指標的大規模檢測(Luminex),再到特定低豐度指標的超靈敏動態監測(Simoa),均能夠提供相應的技術平臺和支撐,構建了1+1+1>3的服務格局。

       目前,華盈生物已完成上萬例樣品的測試和分析工作,樣品類型超過30種。根據自主建立的細胞因子測試數據庫為客戶匹配合適的產品,優選實驗實施方案,大幅度提高了實驗的總體成功率。根據特定的研究目的,華盈生物還可提供超過400種細胞因子的個性化和組合檢測,全方位滿足不同研究人員的實驗需求。


如有相關研究需求,歡迎垂詢:021-33938791-8010(郭博士)
英文鏈接:

https://stm.sciencemag.org/content/11/515/eaaw8287.short

 

 

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